摄食是鱼类个体生长、发育、繁殖等各种活动获得能量的唯一途径[1]。摄食活动受到外周传感因子和中枢神经内分泌系统的共同调控[2]。胃肠道黏膜内的机械和化学感受器能够感受胃肠道的内容物、酸碱度及营养成分含量变化等，上传给下丘脑，下丘脑作为摄食调控中心，整合信号通路和营养因子，通过调控胃饥饿素(ghrelin)、酪酪肽(peptide tryosin tryosin, PYY)、神经肽Y(neu- ropetide Y, NPY)、胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)等多种调节因子表达，将信号反馈给外周组织[3]。
胃饥饿素是由外周分泌的、具有促摄食作用的胃肠肽[3]。胃饥饿素前体有2种基因型，I型含有5个外显子和4个内含子，II型含有4个外显子和3个内含子，两种亚型皆有促摄食作用[4]。X/A样细胞分泌胃饥饿素前体蛋白，主要定位在胃(有胃鱼)或前肠(无胃鱼)中[5]，以细胞形态区分为封闭型和开放型2种，封闭型X/A样细胞多呈圆形，感受胃内压力，而开放型X/A样细胞多呈三角形或长条形，感受胃内化学物质[6]。
胃饥饿素最初在大鼠胃中被发现，并证实了其具有促食欲的作用[7]。目前胃饥饿素已被证实可以促进胃肠动力、增加进食量、调节能量代谢和促进胃酸分泌[8]。在鱼类中，2002年首次成功克隆了金鱼(Carassius Auratus)胃饥饿素基因[9]，至今已在大黄鱼(Larimichthys crocea)[10]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[6]等多种鱼类上确认其存在。禁食和再投喂实验表明大黄鱼胃饥饿素具有促摄食作用[10]。通过力量位移传感器，证明斑马鱼(Danio rerio)胃饥饿素浓度的增加显著升高了肠道紧张性收缩频率[11]。草鱼(Ctenopharyngodon idella)胃饥饿素能够与下丘脑受体(GHS-R)结合激活中枢NPY信号通道，释放神经肽Y和刺鼠相关蛋白(agouti-related protein, AgRP)，同时抑制前阿黑皮素原(proopiomelanocortin, POMC)通道，使食欲增强，摄食量提高[12]。
鳜(Siniperca chuatsi)是典型的肉食性鱼类，自开口期起终生以活鱼饵为食，生产上主要以活鱼饵投喂为主。近年来，鳜饲料驯养研究取得了较快的进展，然而，与活饵投喂相比，饲料驯食后摄食量显著下降[13]。胃饥饿素是外周分泌的促摄食因子，饲料驯食后鳜摄食量的降低是否与胃饥饿素的调控作用相关有待研究。前期，Song等[14]首次获得了鳜胃饥饿素前体的cDNA序列，胃饥饿素前体mRNA在胃中表达水平最高，禁食能诱导其mRNA表达量增加。组氨酸可通过激活脑mTOR信号通路上调胃饥饿素表达，促进鳜摄食[15]。为此，本研究通过比较活饵投喂与饲料投喂条件下，鳜在诱食、进食后不同时间段胃饥饿素mRNA和蛋白表达的变化，进一步明确胃饥饿素在摄食过程中的调节作用，以及饲料驯食后胃饥饿素调节变化，为其饲料养殖提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验用鱼
本研究所用鳜鱼苗购自浙江省湖州市南浔菱湖某家庭农场，全长(5.16±0.44) cm，暂养于上海海洋大学滨海基地水泥池。适应1周后，将所有实验鱼分为活饵组(live bait group, LB)和饲料组(compound food group, CF)，活饵组每日投喂适口鲮鱼，饲料组按曾萌冬[13]方法进行慢性驯化。鳜专用饲料粉购自浙江益祥生物科技有限公司(粗蛋白≥48.0%，粗脂肪≥4.0%，粗纤维≤3%，粗灰分≤19%，钙≥2.0%，总磷≥1.0%，氯化钠≤3.0%，赖氨酸≥2.3%)。饲料组每天饱食投喂2次，时间分别为9:00, 17:00。共进行为期8周的投喂(LB组连续投喂8周活饵鱼，CF组用饲料驯化2周后保持饲料投喂6周)，后开始正式实验。
1.1.2 实验试剂
免疫组化试剂盒(abs996)和PBS (abs9266)购自上海爱必信生物科技有限公司。一抗(鼠单克隆Anti-Ghrelin抗体，ab57222)购自上海Abcam贸易有限公司，该抗体和试剂盒已在斑马鱼[16]、金鱼[17]等鱼类上多次验证其有效性。总RNA提取试剂(TRIzol, DP424)购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒(AG11705)和荧光定量试剂(AG11701)购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，鱼ghrelin Elisa kit试剂盒(ml035512)购自上海酶联生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 胃饥饿素前体基因DNA序列分析
从本实验室鳜转录组数据库中搜寻胃饥饿素cDNA序列，利用该序列匹配鳜基因组数据库，获得胃饥饿素前体基因DNA序列。利用Bioedit软件将胃饥饿素cDNA序列与其前体基因DNA序列进行比对，得到非编码区、外显子与内含子序列。利用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)寻找开放阅读框，并预测氨基酸序列。利用SignalP5.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/)预测信号肽的切割位点。利用ProtParam (https://web. expasy.org/protparam/)预测氨基酸分子量和pI值。将预测的鳜胃饥饿素前体氨基酸序列与其他脊椎动物氨基酸序列进行比较，利用NJ法构建进化树。
1.2.2 免疫组化
随机取LB组3尾，用MS-222 (1∶10000)麻醉，取出胃组织，放入4%多聚甲醛(pH7.2, 4 ℃)中固定24 h，再经分级乙醇系列脱水，二甲苯透明后，包埋于石蜡中并切片(厚度为5~8 µm)，干燥过夜。实验步骤参考免疫组化试剂盒说明书。组织经脱蜡和复水后，用Tris-EDTA缓冲液(pH9.0)进行抗原修复(95 ℃, 20 min)，后用内源性过氧化物酶封闭剂室温孵育10 min。将组织与鼠抗(1∶500，鼠单克隆Anti-Ghrelin抗体，ab57222)在37 ℃潮湿环境下孵育40 min，再与二抗(HRP酶标抗小鼠&兔二抗聚合物)于潮湿避光37 ℃环境下孵育30 min。组织经PBS洗涤后，用DAB显色液室温显色5 min，苏木精复染后水洗反蓝，并封片。在光学显微镜(BK-DM500，重庆奥特光学仪器有限责任公司)下观察、拍照。
1.2.3 诱食实验
取喂养8周的LB组和CF组鳜各2组，共4组，分别暂养于水族箱内(0.6 m× 0.3 m×0.35 m)，箱内中间放置一个透明盒(15.0 cm× 10.0 cm×15.0 cm)，饥饿48 h后开始试验。分别向透明盒内投喂活鱼饵或饲料，投喂过程持续10 min，保证每条试验鱼仅能看到食物但不能摄食，投喂活饵记为活饵诱食(live bait attraction, LBA)，投喂饲料记为饲料诱食(compound food attraction, CFA)。4个实验组分别记为：活饵组–活饵诱食(live bait-live bait attraction, LB-LBA)、活饵组-饲料诱食(live bait-compound food attraction, LB- CFA)、饲料组-活饵诱食(compound food-live bait attraction, CF-LBA)和饲料组–饲料诱食(compound food-compound food attraction, CF-CFA)。每组10尾，设3个平行组。
诱食结束后，每实验组随机取5尾，用MS-222(1∶10000)麻醉，解剖取出胃组织，用DEPC水清洗后装于冻存管，保存于液氮中，用于荧光定量PCR和ELISA检测。
1.2.4 进食实验
取喂养8周的LB组和CF组鳜进行进食实验，共2组。饥饿48 h后，LB组投喂活饵，CF组投喂饲料，至表观饱食点后结束投喂。每组20尾，平行3组。
先采集餐前~0 h胃组织。饱食投喂后，采集餐后0 h、2 h、8 h、16 h、24 h及28 h (直至胃排空)，每实验组每个时间点抽取5尾。实验用水族箱和采样方法同上。
1.2.5 实时定量PCR
使用TRIzol法提取RNA试剂盒，提取胃总RNA，并测定质量和浓度。使用艾科瑞反转录试剂盒(AG11705)将RNA逆转录为cDNA。根据鳜胃饥饿素前体cDNA序列，利用Primer 5设计引物(引物序列为表1)。PCR反应液含10 µL PCR Master mix、1 µL cDNA模板、上下游引物各0.8 µL、RNase-free水7.4 µL。PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s；特定退火温度53.4 ℃，退火30 s; 72 ℃ 60 s延伸，30个循环；最后72 ℃延伸5 min，并储存在4 ℃。荧光定量PCR在定量热循环仪(Bio- Red, USA)中进行。反应体系包括：10 µL 2×SYBR® Green Prc Taq HS Premix、1 µL cDNA模板、上下游引物各0.4 µL、RNase-free水8.2 µL。反应程序包括：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 8 s、53.4 ℃ 30 s下进行40个循环；随后95 ℃ 15 s, 65 ℃ 1 min, 95 ℃ 30 s并结束程序。每个RNA样品一式3份进行。
1.2.6 酶联免疫分析
应用双抗体夹心法测定胃饥饿素蛋白水平。用纯化的胃饥饿素捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入胃饥饿素，再与HRP标记的检测抗体结合，彻底洗涤后加底物TMB显色。实验用量和反应步骤按照说明书进行。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中胃饥饿素含量。
1.2.7 统计分析
统计结果以平均值±标准差($\bar{x}\pm \text{SD}$)表示。结果由SPSS 22.0处理。方差齐性检验后，采用单因素方差分析或t检验对数据进行分析。P<0.05表示差异显著。
表1
表1 实时定量PCR引物
Tab. 1 Primers for real-time PCR determinations of the studied genes
基因gene
引物名称primer
序列 (5ʹ–3ʹ) sequence (5ʹ–3ʹ)
GenBank ID
ghrelin
ghrelin F
TTGCTGGTCTTCCTGTTGTGT
ON652818
ghrelin R
TTCCCCTTGTTCTGAGGTTTT
β-actin
B F
GTGCGTGACATCAAGGAGAAG
AY885683.1
B R
GGAAGGAAGGCTGGAAGAGG
表1 实时定量PCR引物
Tab. 1 Primers for real-time PCR determinations of the studied genes
2 结果与分析
2.1 鳜胃饥饿素前体基因序列
鳜胃饥饿素前体基因DNA序列全长1717 bp，包括4个外显子和3个内含子，开放阅读框324 bp，共编码107个氨基酸(图1)。5ʹUTR长151 bp (1~151 bp)；第1个外显子长114 bp (152~265 bp)，编码38个氨基酸(Met1-Gln38)；第2个外显子长78 bp (1007~1084 bp)，编码26个氨基酸(Asn39~ Thr64)；第3个外显子长112 bp (1170~1281 bp)，编码37个氨基酸(Ile65~Ala101)；第4个外显子长20 bp (1372~1391 bp)，编码6个氨基酸(Glu102~Leu107)；最后为326 bp (1392~1717 bp)的3ʹUTR。3个内含子长分别为741 bp (266~1007 bp), 85 bp (1169~1085 bp), 90 bp (1282~1371 bp)，每个内含子两端均具有剪切供体和受体位点(GT/AT)。
图1
图1 鳜胃饥饿素前体基因序列与推导氨基酸序列绿色片段示5ʹ非编码区和3ʹ非编码区. 红色片段示编码区，共4个片段. 蓝色片段示内含子，共3个片段. 蓝色横线示信号肽区域，黄色横线示成熟肽区域，绿色横线示C端肽区域. 红色方框示活性中心. *代表终止密码子.
Fig. 1 Preproghrelin gene sequence and deduced amino acid sequence of Siniperca chuatsiGreen segments indicate 5ʹUTR and 3ʹUTR. Red fragments show coding DNA sequence (CDS), 4 segments in total. Blue fragments indicate introns, 3 intros in total. The blue horizontal line indicates the signal peptide region. The yellow horizontal line indicates the mature peptide region. The green horizontal line indicates the C-terminal peptide region. The red square indicates the active core. * represents the stop codon.
胃饥饿素前体蛋白由信号肽、成熟肽、C端肽3部分组成。信号肽由N-端26个氨基酸构成(Met1~Ala26)；成熟肽胃饥饿素由随后的20个氨基酸构成(Gly27~Val46); C端肽由剩下的61个氨基酸构成(Gly47~Lys107)。成熟肽分子量和理论pI值为2189.50和11.26，前7位氨基酸保守性较高，第3位丝氨酸(Ser29)具有潜在的酰基化修饰位点，构成“GSSF”活性中心。
鳜胃饥饿素前体氨基酸序列与硬骨鱼类相似度较高(图2)。其中，与大口黑鲈(Micropterus salmoides)一致性最高(85.9%)，与鸟类、两栖类、哺乳类一致性较低。不同物种胃饥饿素前体氨基酸序列构建的系统发育树，硬骨鱼类单独聚成一支，鳜与鲈形目聚成一个分支(图3)。
2.2 免疫组化定位
免疫组化结果显示，黏膜层褶皱形成胃小凹，基部含有胃腺。Ghrelin阳性细胞主要分布于黏膜层的胃腺中(图4)，分布较疏。
2.3 诱食期胃饥饿素表达水平变化
与饥饿状态相比，活饵组在不同诱食条件下，胃饥饿素mRNA表达水平皆显著提高(P<0.05)，且活饵诱食表达水平显著高于饲料诱食(P<0.05)；而饲料组在不同诱食条件下，胃饥饿素mRNA表达水平皆无显著变化(P>0.05)。同时，在相同饥饿/诱食条件下，饲料组胃饥饿素mRNA表达水平皆显著低于活饵组(P<0.05)(图5)。
图2
图2 脊椎动物胃饥饿素前体氨基酸序列多重比对蓝色方框示信号肽，红色方框示成熟肽，绿色方框示C-端肽. *表示代表此位点氨基酸残基完全一致，：代表此位点氨基酸残基性质特别相近，.代表此位点氨基酸残基性质微弱相近.
Fig. 2 Multiple alignment of amino acid sequences of preproghrelin in vertebratesThe blue box shows the signal peptide. Red box shows maturation peptide. Green box shows C-terminal peptide. * indicates positions which have a single, fully conserved residue. : indicates that amino acid residue properties at this site are particularly similar, and . indicates that amino acid residue properties at this site are slightly similar.
图3
图3 基于脊椎动物胃饥饿素前体氨基酸序列的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree based on preproghrelin amino acid sequences of vertebrates
图4
图4 鳜胃饥饿素免疫组化细胞定位a：免疫阳性细胞(箭头); b：对照组. GG：胃腺；GP：胃小凹；MA：黏膜层；SM：黏膜下层. 箭头指向为阳性细胞，a内小框为虚线范围所示内容.
Fig. 4 The localization of the immune response to ghrelin in Siniperca chuatsia. Immunoreactivecells (arrow); b. Control group. GG: gastric gland; GP: gastric pit; MA: mucous layer; SM: submucosa. Arrows point to positive cells, and the small box in figure a is the content shown in the dotted line range.
图5
图5 不同诱食组鳜胃饥饿素mRNA相对表达水平不同字母表示不同诱食方式下差异显著(P<0.05). LB：活饵组；CF：饲料组；LBA：活饵诱食；CFA：饲料诱食.
Fig. 5 Relative expression levels of ghrelin mRNA in live-bait groups and compound food groups of Siniperca chuatsi under different food enticementsDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). LB: live bait group; CF: compound food group; LBA: live bait attraction; CFA: compound food attraction.
与饥饿状态相比，诱食条件未引起活饵组、饲料组胃饥饿素蛋白表达水平显著变化(P>0.05)。同时，在相同饥饿/诱食条件下，饲料组胃饥饿素蛋白表达水平表达显著低于活饵组(P<0.05)(图6)。
2.4 进食前后胃饥饿素表达水平变化
进食后0 h，活饵组胃饥饿素 mRNA表达水平上升达最高峰；进食后2 h，下降到摄食前水平(P>0.05)；进食后2~24 h，无显著变化(P>0.05)。进食后0 h，饲料组胃饥饿素mRNA表达水平下降，进食后0~28 h，无显著变化(P>0.05)。进食前、后不同时期，饲料组胃饥饿素 mRNA表达水平均显著低于活饵组(P<0.05)(图7)。
图6
图6 不同诱食组鳜胃饥饿素蛋白表达量不同字母表示差异显著(P<0.05). LB：活饵组；CF：饲料组；LBA：活饵诱食；CFA：饲料诱食.
Fig. 6 Content of ghrelin protein in live-bait groups and compound food groups of Siniperca chuatsi under different food enticementsDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). LB: live bait group; CF: compound food group; LBA: live bait attraction; CFA: compound food attraction.
进食后0 h，活饵组ghrelin蛋白含量显著上升(P<0.05)；进食后2 h，含量显著下降；进食后2~24 h，含量没有显著变化(P>0.05)。饲料组进食后0~28 h，含量呈波动变化(P>0.05)。进食前、后不同时期，饲料组胃饥饿素含量显著低于活饵组(P<0.05)(图8)。
3 讨论
本研究基于鳜转录组数据与基因组数据联合分析，获得了胃饥饿素前体基因DNA序列。该基因由4个外显子和3个内含子组成，为II型基因型。在目前已知的大部分鱼类中，胃饥饿素前体基因均为II型基因型[18]，仅少数鱼类，如虹鳟[6]同时存在I、II型基因型(I型基因由5个外显子和4个内含子组成)。鳜胃饥饿素前体蛋白包括3个结构域：信号肽、成熟肽和C-端肽，成熟肽包含20个氨基酸，其活性中心由前4个氨基酸组成，为“GSSF”，这与Song等[14]的研究结果一致。部分鲤科鱼类的胃饥饿素活性中心由“GSSF”突变为“GTSF”，这是由于单碱基替代(AGC-ACC)导致，而Ser与Thr在功能上是相似的，故不会影响胃饥饿素结构和生物学功能[19]。该活性中心第3位为丝氨酸，能够与酰基结合从而活化[4]。金鱼虽只含有II型基因型，但其氨基酸序列中发现存在2个酰胺化位点，可加工成为具有12个或19个氨基酸残基的活性多肽[20]。
图7
图7 不同投喂方式下鳜胃饥饿素mRNA 相对表达水平不同字母表示活饵组与饲料组胃饥饿素相对表达量差异显著(P<0.05). LB：活饵组；CF：饲料组.
Fig. 7 Relative expression levels of ghrelin mRNA under different feedings of Siniperca chuatsiDifferent letters indicate significant difference of ghrelin relative expression level between LB and CF (P<0.05). LB: live bait group; CF: compound food group.
图8
图8 不同投喂方式下鳜胃饥饿素蛋白含量不同字母表示差异显著(P<0.05). LB：活饵组；CF：饲料组.
Fig. 8 Content of ghrelin protein under different feedings of Siniperca chuatsiDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). LB: live bait group; CF: compound food group.
免疫组化结果显示，鳜胃饥饿素阳性细胞分布于胃黏膜层中的胃腺位置，这与欧洲舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)[21]、虹鳟[6]相似。胃是肉食性鱼类的重要消化场所，进食后，食物刺激促使胃腺细胞分泌胃酸与胃蛋白酶原[22]。鳜胃饥饿素分泌细胞的胃腺定位表明其可能是摄食调控中机械感应、营养感应等过程的重要因子。Lewin[23]将胃饥饿素阳性细胞细分为封闭型细胞和开放型细胞，认为封闭型细胞受到激素、神经元刺激或机械膨胀的调节，开放型细胞通过接收腔内信息(如营养和pH等)来调节。在虹鳟[6]中也同样发现了2种不同的阳性细胞，引起鱼类胃饥饿素分泌的机制还有待进一步研究。
诱食试验模拟鳜捕捉食物但未摄食阶段，排除了气味和水流的干扰，仅保留视觉对摄食的影响。进食试验模拟鳜捕捉并摄食阶段。本研究中，活饵诱食时，活饵组胃饥饿素 mRNA相对表达量皆显著上升，说明在摄食前其食物信号通过视觉传递至脑并反馈至胃，引起食欲提高。进食后，胃饥饿素 mRNA和蛋白表达呈现出先上升后下降的趋势，后期胃饥饿素的表达没有发生变化，说明胃饥饿素主要参与摄食前调节作用。本研究结果与金鱼[24]、欧洲舌齿鲈[25]摄食前后胃饥饿素表达变化类似，但在虹鳟[26]中没有观察到摄食前后胃饥饿素的变化。值得注意的是，饲料诱食同样也能引起活饵组鳜胃饥饿素表达上升，表明鳜摄食饲料时视觉起到一定作用。这为生产上鳜可被饲料驯食提供了重要的生理基础。
本研究中，饲料组进食前后胃饥饿素mRNA和蛋白水平均未产生明显变化，这可能是饲料对鳜的营养调控产生了影响。研究表明，由于配合饲料中存在营养不平衡性和抗营养因子，饲料投喂会导致鳜肝脏脂肪含量上升，摄食量下降[13]。长期高脂投喂下，鳜产生厌食反应，并造成持续高血糖症[27]。长期处于高脂投喂下，小鼠胃饥饿素的表达水平及其阳性细胞的数量显著降低[28]。同时，营养感应机制能够调控胃饥饿素分泌水平。有研究表明餐后胃饥饿素的下降还与食物营养组成、小肠吸收功能与营养传感等关联[29]，长期投喂饲料的鳜肠道小肽吸收功能下降[13]。高脂高蛋白投喂小鼠导致胰岛素敏感性下降，从而在摄食前后胃饥饿素没有显著变化[30]。本研究中，饲料组在诱食、进食过程中胃饥饿素 mRNA与蛋白处于低水平表达，且诱食阶段、摄食前后胃饥饿素表达未出现显著变化，表明饲料投喂后鳜在摄食过程中胃饥饿素的调控作用减弱。饲料投喂下鳜胃饥饿素表达与分泌调控机制，还有待深究。
4 结论
本研究首次分析了鳜胃饥饿素前体基因DNA序列，属于II型基因型。胃饥饿素细胞位于胃腺中。活饵组诱食时胃饥饿素表达量显著上升，进食前、后表现出先上升后下降的趋势；饲料组胃饥饿素含量显著降低，诱食、进食前后表达变化不明显。鳜胃饥饿素参与摄食调节，而饲料投喂后胃饥饿素摄食调节作用减弱。